출처 : 골인원외탕전 홈페이지
중앙의학 The Korean Central Journal of Medicine Vol.28, No.5, May, 1975
부자제 투여로 인한 간세포 변화에 관한 전자현미경적 연구
경북대학교 의과대학 신경정신과학교실 이시형
An Electron Microscopic Study of the Changes of the Hepatocyte of Aconite Treated Rats
Si-Hyung Lee. M. D.
Dept. of Neuropsychiatry, Kyungpook National University, School of Medicine
<Abstract>
Author's previous two reports indicate that aconite preparation has a significant effect on accelerating blood alcohol clearance rate, however, ihs mode of action has remained uncertain. Author presumed that, of the two major pathways of alcohol metabolism, increased MEOS activity rather than ADII pathway would be respinsible for this effect.
This is a study of the effect of aconite preparation on the morphological changes of rat liver cells vy electron microscopy. 0.2gm of specially detoxofied aconite preparation was given to the rat three times each at four hour interval. The liver specimen was obtained one hour following the last dosage.
findings ae summarized as follows;
1) Aconite treated liver cell showed that while rER were decreased proliferation of sER was significandtly increased, which was considered as a reliable indicator of increased MEOS activity in the liver cell. GERL and Golgi complex were also significantly proliferated indicating a rise in secretory activity of the liver cells.
2) Signs of a mild degree of degenerative changed of organelles were observed; ie, destruction of ribosome, fragmentation of rER, and changes of mitochondriae(decrease and deformoty of cristae, decreased density due to swelling, and increased mitochodrial granule), however, these changes were not considered as a sign of serious cell damage.
3) Though lysosome was slightly increased as a reacive change following the above stated degenerative dhangem autophagic vacuole was not increased indicating the phenomenon of sequestration had not taked place yet. This is largely due to the short time interval between the last dosage given and the specimen obtained.
In summarizing the above findings, aconite treated animals showed significantly increased MEOS activity resulting from increased proliferation of sER, and it became a ontributing factor in accelerating blood alcohol clearance rate.
Lastly, since sER is known to have many vitally important functions, the claim, made by herb medicine, that aconite is highly effective in controlling various clinical syndromes would be worth looking into.
<서론>
부자는 그 독성 때문에 서양의학에서는 거의 사용되지 않고 있으나 한방에서는 여러 가지 증상에 효과적으로 쓰여져 왔다. 저자는 선행연구에서 부자 및 유황의 복합제제가 음주 후 숙취현상에 치료적 효과가 큼을 임상실험에서 밝혔고 또 그 기전을 구명함에 있어 가토혈중주정농도에 미치는 영향에 관한 실험적 연구에서 부자제가 혈중주정대사를 현저히 촉진시킨 결과를 보고한 바 있다.
주정대사는 대부분(90% 이상)이 간세포에서 이루어지고 그 중 약 3/4은 ADH(alcohol dehydrogenase pathway로, 나머지 1/4은 MEOS(microsomal ethanol oxidizing system)activity를 통해 이루어지는 것으로 되어 있어서 부자제제의 투여로 촉진된 주정대사가 어느 기전으로 되어지는가는 의문으로 남아있다.
그래서 본 실험은 부자제의 주정대사촉진은 비교적 한정성이 있는 ADH patheway 보다는 MEOS activity에 의한 것임을 시준한 선행연구의 가설을 검토함에 있다. 주정대사에 있어서 간세포의 microsome이 관여한다는 관찰은 1964년 Iseri 등의 보고에서 비롯된다고 Lieber3)는 다음과 같이 정리하였다.
그들은 주정투여한 쥐의 간세포에서 microsomal fraction인 sER(smooth-surfuced endoplasmic reticulum)의 현저한 증가를 보고하였고, 그 후 Iseri, Rubin et al. 가 쥐에서 Lane & Liever, Rubin & Lieber 등이 사람에서, 그리고 최근 Ishii et al.이 화학적으로 이와 유사한 보고를 하였다.
Lieber & Decaril4)은 이런 sER의 증식은 곧 MEOS activity의 증가를 의미하고 이것이 주정대사를 촉진시키는 한 요인으로 설명하였다.
그래서 본 연구는 부자제가 간세포의 미세구조에 미치는 형태학적 연구를 통해 그것이 주정대사에 미치는 기전을 구명코저 함에 있다.
<실험재료 및 방법>
실험동불은 체중 250gm 내외의 성숙한 쥐를 암·수 구별 없이 사용하였으며 아무런 처치를 하지 않은 비교군과 부자제를 투여한 실험군으로 나누었다.
실험군은 부자제 0.2gm을 5cc의 증류수에 용해시켜 4시간 간격으로 3회에 걸쳐 같은 량을 catheter를 통해 경구투여하였다. 최종투여 1시간 후에 쥐를 회생시켜 간의 조직학적 검사를 실시했다. 전자현미경적검사는 0.2M이 되도록 sucrose를 가한 pH 7.4의 phosphate buffer로 조정한 0~4℃의 OsO4(1%)용액에 투입하여 1mm3의 조직편을 만들어 고정하였다. 탈수는 ethanol로, penetration은 Qy-1으로써, 그리고 포매는 Luft씨 방법에 의한 epoxy resin으로 하였다.
다음에 porter-blum ultramicrotome MT-2 type으로서 glass knife를 사용하여 400~600Å으로 박전하여 uranyl acetate와 lead nitrate로 electron double stain을 하여 Hitachi Hu-11E-1 전자현미경으로 관찰하였다.
<실험성적>
전자현미경적 소견
1) 대조군 : 기본식만으로 아무런 처치를 않은 쥐의 간세포들의 전자현미경적 소견은 poter와 Bruni를 위시한 다른 한자들이 관찰한 소견과 일치하였다. 즉 간세포의 핵은 대략 둥글고 전자밀도는 비교적 낮으며 핵소체는 저명하였다. 세포체내에는 mitochondria, rER(rough-sirtaced endothelial reticulum), sER, glycogen particle, golgi-complex, 그 밖에 lipid particle등이 보였다. Glycogen-particle은 소집단을 형성하여 산재하는 경향이 있으며 특히 sER와 같이 있는 경우가 많다. REP는 flattened sac을 나타내었고, 대체로 서로 평행하게 배렬되어 소집단을 만들고 이들 집단은 세포전체에 겹쳐서 산재하고 있었으며 glycogen particle과는 공존하지 않는 경향을 나타내었다. Golgi complex는 보통 세포체내에 산재하는 경향을 보였으나 특히 핵과 blecanaliculi 사이에 많이 보였으며 lamella, vesicle, vacuole등의 구조물들을 볼 수 있었다. Mitochondria는 이들 구조물 사이에 많이 흘러져 있었으며 그 모양은 round 내지 oval하고 matrix는 풍부하며 cristae는 비교적 적은 편이다.
2) 실험군 : Cytocavitary network에 일어난 변화를 총괄하면, rER의 감소와 동반하여 ribosome이 탈락한 rER의 증가, sER의 증식, 세포질내에 여러 가지 공포(vacuola) 및 수포 (vesicle)의 증가, golfo complex의 증식 및 lysosome의 증가 등이었다 rER은 mitochondria사이의 세포질에 산재하였으나 대부분은 그 막에 부착한 ribosome이 부분적으로, 혹은 완전히 탈락하였다. 이들의 배열은 정상인 간세포에서 관찰되는 바와 같이 잘 발달한 편펑낭상, 혹은 관상구조가 수층이 나란히 배열된 형태, 즉 lamellar structure를 유지하고 있는 것은 적고, 대부분이 disorganize되었거나, fragmentation이 되어 불규칙한 모양을 한 공포상으로 산재되어 있다. Ribosome은 이들의 막으로부터 탈락하여 세포질 기질에 유리된(free) 상태로 존재하는 것이 많았으며 이들 유리된(free) ribosome의 일부는 파괴되고, 파괴된 조각들이 모여 더 미세한 과립상을 정하고 있는 곳도 있었다. 이런 곳에서는 전체적으로 보아 free ribosome이나 attached(membrane bound) ribosome 모두가 감소되어 있었다. 이렇게 분절화(fragmented)된 rER의 질내에는 대부분이 미세한 과립상의 물질을 함유하고 있었으나 전체적으로 보아 이들 질내의 전자밀도는 주위의 세포기질보다 낮았다.
sER은 상당히 증식하였고, 이들은 mitochondria 사이의 세포질에 집단적으로 모여있었다. 어떤 장소에서 이들 증식한 sER 집단 근처에는 ribosome이 부분적으로 부착된 rER도 있어 ribosome이 탈락한 rER인지 순수한 sER의 증식인지 구별하기가 곤란한 장소도 있었으나, 어떤 장소에서는 분명히 sER의 증식이라고 할 수 있는 것이 더 많았다. sER이 증식한 장소에는 정상적으로 존재하는 glycogen particle은 상당히 감소하여, 이들 증식된 구조물은 masking 되지 않고 그 형태가 잘 보존되어 있었다. 증식한 sER은 대체로 공포상을 나타내었으나 모양은 상당히 불규칙하여 sawtooth appearance를 보이는 것이 많았고, 그 크기는 상당한 대소부동이었다. 이들의 크기는 대체로 분절화된 rER의 강보다 더 큰 경향이 있으며, 그 내에는 미세한 과립상의 물질이 혹은 성글게, 혹은 빽빽하게 함유되어 있어 대체로 rER의 강보다는 그 전자밀도가 높은 편이었다.
sER 혹은 rER 외에, 세포질에는 여러 가지의 공포상 혹은 수포상 구조물이 증가하였는데, 이들은 산재하는 것도 있었으나, 대부분이 golgi complex에 가까운 장소에 있었으며, 이들의 강내에는 여러개의 coarse granule들을 함유하고 있었다. 이와 유사한 내용물을 함유한 공포들은 golgi complex 주위에 모여있으며, 이중 어떤 것들은 한줄 혹은 두어줄로 나란히 배열하여 golgi complex로 이행하는 과정을 보여주는 곳도 있었다. 그래서 이들 공포상구조물은 ER에서 유래되어 golgi complex로 이행하는 과정에서 나타나는 구조물, 즉 Novikoff가 제안한 golgi-assocoated endoplasmic reticulum(GERL)로 생각되었다.
Golfi complex는 그 수가 상당히 많아졌으며, 이것의 구성은 주로 vacuolar component이었다. 이들 vacuolar component내에는 전술한 GERL의 내용물과 동질성의 물질이 함유되어있어 golgi complex의 증식은 이들 GERL의 종축적 융합의 결과로 해석되었다.
Lysosome의 수도 상당히 증가하여, 이들은 특히 peribiliary space에 많이 나타났다. 이들의 내용물은 공포상의 것이 많았으며 기질은 절자밀도가 상당히 증가되어 나타났다. 어떤 장소에서는 Hruban 등이 지적한 focal cytoplasmic defradation(FCD), 즉 De Duve의 autophagic vacuole들도 나타났다. 이들은 변성된 소기관들, 즉 ribosome, mitochondria, endoplasmic reticulum등이 국소적으로 모여있고 그 주위는 두곳의 막, 즉 arstils 등이 지적한 바와 같이 ER의 막으로 쌓여져있는 형태를 취하고 있었으며, 이들 중 어떤 것은 그 기질의 전자밀도가 증가되어 primary lysosome의 작용을 받고 있는 것으로 생각되는 것들도 관찰되었다. 그러나 이들 구조무르 즉 소기관의 변성으로 인한 autophagosome의 형성은 대조군에 비해 현저하게 증가한 것은 아니었다.
Mitochondria는 대부분이 상당히 커지고 cristae는 성글게 분포되어 있었다. cristae는 거의 소실하고 이중의 막으로 쌓인 공포처럼 나타나는 것도 있었으나 그 수는 적었다. Mitochondria의 변록은 거치상을 정하고 전체적인 모양도 상당히 불규칙하였다. Matrix는 mitochondria가 종창되고 cristae는 감소하였기 때문에 상당히 넓은 부분을 차지하고 그 전자밀도는 대조군에 비하여 낮은 경향을 보였으며, 그 내에는 ribosome정도의 크기 혹은 훨씬 더 크고 전자밀도가 상당히 높은 과립들, 즉 mitochondrial granule들이 많이 증가하였다.
<고안 및 총괄>
부자제제로 처치된 쥐의 간세포에서 발견된 전자현미경 소견들을 본 연구목적과 연관시켜 고찰해 보고져 있다.
우선 MEOS Activity가 상승된 것을 시사하는 소견으로서는 무엇보다 rER의 감소와 그리고 rER에서의 이행을 시사하는 부분들도 보이는 등 전체적으로 볼 때 sER에는 비단 주정대사뿐 아니고 여러 가지 즉 광범위한 약물의 해독작용이 관여하는 많은 효소들이 존재하고 있다.
Remmer와 Merkev는 쥐에 phenobarbital을 연속투여 했을 때 간세포에 sER가 증식해서 microsome에서의 약물대사효소, 즉 탈 methyl기, 수산화, 산화, ester화 등에 관여하는 산소의 활성이 상승하는 것을 발견하고 이들 효소가 sER에 국재하는 것을 보고했다. 그 후 이러한 현상은 phenobital뿐 아니고 일반적으로 지용성약물에 의해서도 일어나는 것을 알게 되었다.
그래서 오늘날 sER 증식에 따라 microsome에서의 약물대사활성도 같이 상승한다는건 잘 알려져 있다. 특히 지용성 약물 투여 후 일어나는 이러한 현상은 그 약물이 sER막의 린지질에 용해되어 거기서 대사되어지는 반응상으로 풀이되고 있다. 따라서 sER의 이러한 약물에 의한 증식은 간세포의 해독반응의 항진을 의미하는 것으로 Yamamoto는 결론짓고 있다. 15)
그다음 golgi complex의 구성요소인 수포 및 공포 등의 GERL, 그리고 완성된 golgi complex의 현저한 증가 등은 간세포내에서의 secretory activity가 상승한 것을 의미하므로 약물대사효소의 활성이 상승함에 따른 해독작용이 왕성해져서 해독된 물질의 운송이 증가된 소견으로 간주된다. 또 상당히 감소된 glycogen 과립은 위의 증식, 특히 sER 및 golgi complex에 필요한 energy원으로서 소모된 것으로도 간주되어 간세포내에 약물해독의 역사가 상승된 다른 하나의 보충소견이 된다고 보아진다.
그러나 상기의 소견과 동시에 관찰되는 ribosome의 파괴, RER의 fragmentation, mitochondria내의 여러 가지 변화, 즉 cristae의 감소, 종창으로 인한 density의 감소, 그리고 전해질장애에 따른 과립의 증가 등은 단백질합성 및 energy 생산에 관여하는 소기관에 일어난 가벼운 퇴행성 변화로 간주된다. 그리고 lysosome도 약간 증가된 소견을 보였는데 이것은 상기와 같은 소기관들의 변성으로 인한 반응성 변화로 생각하였으나 autophagic vacuole의 증가는 현저하지 않은 걸로 보아서 변성된 소기관을 sequestration시키는 현상은 아직 일어나지 않은 것으로 풀이되었다.
이것은 시간적으로 보아서 최후투약 1시간에 절제하였으므로 반응성변화는 아직 일어나지 않았다고 보겠으나 경시적 검사를 했더라면 시간이 경과함에 따라 증가될 것으로 추정된다. 사실 본 경험은 시간의 경과에 따른 여러 변화를 추적 관찰함이 마땅하나 이것은 다음의 연구관제로 미루고 이번은 sER 증식유무에 대한 pilot study를 하는데 그친 것을 첨언해둔다. 여하튼 위의 이러한 변화로써 이들 소기관들이 회복할 능력이 상실된 정도의 손상이라고 볼 수 없으므로 본제가 세포에 손상을 입혔다고 보기는 어렵다.
위의 소견들을 종합하면 부자제제가 간세포의 sER증식을 통한 MEOS activity의 상승으로 인해 혈중 alcohol clearance rate가 촉진된 것으로 해석하는데 무리가 없을 것이다. 끝으로 일반적으로 sER가 증식된 경우 투여된 약물의 대사에 특이적인 효소만을 유도하는게 아니고 비특이적으로 본래 간세포 sER에 함유된 산소군을 유도한다. 이렇게 두고 볼 때 부자제 자체를 대사시키기 위한 반응으로 해석되며 그 결과 이차적으로 주정대사를 촉진시키게 된 것으로 풀이된다.
그리고 일단 증식된 sER는 알콜대사뿐 아니고 다른 여러 가지 약물에 대한 해독작용 외에 지질, cholesterol 및 glycogen 대사, 그리고 ion 조절 등 여러 가지 기능이 있으므로 한방에서 여러 가지 증상에 유효하다는 부자의 기능을 이런 측면에서 앞으로 연구해 볼 가치가 있을 것으로 사료된다.
<요약>
부자제의 주정대사촉진의 기전을 구명코져 체중 250mg내외의 쥐를 사용하여 4시간 간격으로 0.2gm 씩의 부자제를 3회에 걸쳐 투여하여 간세포에 일어난 형태학적검사를 전자현미경을 통해 관찰한 겨롸를 아래에 요약한다.
1) 비교군에 비해 실험군의 간세포에서 주정대사를 촉진시키는 MEOS activity 증가를 지지하는 소견, 즉 rER는 감소된 반면 sER의 현저한 증식이 있었다. 그리고 간세포내에서의 secretoty activity가 상승한 것을 시사하는 GERL 및 golgi complex의 증식도 현저하였으며 glycogen 과립이 감소는 위의 증식에 필요한 energy원으로서 소모된 것으로도 간주되어 약물해독의 역가가 전체적으로 보아서 상승된 특이소견을 보였다.
2) 세포내의 소기관에 가벼운 퇴행성변화를 시사하는 다음과 같은 소견들이 발견되었으나 이것은 극히 경미한 변화로 간주되었다. 즉 ribosome의 파괴, rER의 fragmentation, motochondria내의 여러 가지 변화(cristae의 감소, 종창으로 인한 density의 감소, 전해질장애에 따른 과립의 증가들이었다.
3) Lysosome도 약간 증가하여 위와 같은 소기관의 변성으로 인한 반응성변화가 일어난 것으로 간주되나 autopahgic vacuole의 증가는 현저하지 않아서 sequestration 현상은 일어나지 않았다. 이것은 본 실험이 최종투약 후 1시간에 절제된데 기인한 것으로 보며 경시관찰은 다음의 연구관제로 미룬다.
위의 소견들을 종합해서 부자제제가 간세포의 sER 증식을 통한 MEOS activity의 상승으로 인해 blood alcohol clearance rate가 촉진된 것으로 해석된다.
끝으로 일단 증가된 sER는 그 원래의 여러 가지 기능을 생각할 때 한방에서 주장하는 부자제의 광범한 임상효과는 이런 측면에서 연구되어져야 할 과제가 될 것을 부언한다. (본 실험을 위해 많은 가르침과 도움을 주신 병리학교실의 손대중, 서인수, 양 선생님께 심심한 사의를 표하며 바쁜 공부시간에 도와준 의학과 4년생 홍재봉, 이웅인, 함인석 제군에게 감사드린다.)
- References -
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